Zo werkt een COVID-19 test

Van materiaalafname bij de patiënt tot uitslag. Dit zijn de stappen in het moleculaire laboratorium bij het testen op het coronovirus.

Moleculaire diagnostiek

Moleculaire diagnostiek behelst de laboratoriumdiagnostiek waarbij gebruik wordt gemaakt van geavanceerde technieken om genetisch materiaal (DNA of RNA) van bijvoorbeeld mensen, dieren, planten en micro-organismen te onderzoeken. Op medisch microbiologische en moleculaire laboratoria wordt moleculaire diagnostiek toegepast om o.a. ziekteverwekkers zoals bacteriën, virussen en schimmels aan te tonen in diverse patiëntmaterialen.

Een veelvuldig gebruikte techniek om genetisch materiaal van bijvoorbeeld bacteriën en virussen aan te tonen, is de zogenaamde real-time PCR-reactie. Bij een real-time PCR-reactie wordt een specifiek stukje genetisch materiaal van een organisme dusdanig vaak vermenigvuldigd zodat het kan worden aangetoond. Voordat het genetisch materiaal echter kan worden vermenigvuldigd, dient het eerst uit de cellen vrijgemaakt te worden. Dit wordt de (nucleïnezuur)extractie genoemd. Bacteriën bevatten DNA als genetisch materiaal en de meeste virussen (waaronder het nieuwe coronavirus) bevatten RNA als genetisch materiaal.

Een Medisch Moleculair Microbioloog (MMM) heeft een universitaire opleiding gevolgd en is o.a. vakinhoudelijk verantwoordelijk voor de uitvoering van deze technieken op het laboratorium en de interpretatie van de resultaten. Hij of zij kan ervoor kiezen om deze testen zelf te ontwikkelen (een Lab Developed Test of LDT) of gebruik te maken van commercieel verkrijgbare testen. In Nederland wordt veel gebruik gemaakt van Lab Developed Tests.

Hoe wordt SARS-CoV-2 aangetoond?

Stap 1: Afname van testmateriaal bij patiënten
Met een speciaal wattenstaafje (swab) wordt bij een patiënt in de neusholte en/of keel testmateriaal afgenomen. Deze afname komt erg nauw en dient door getraind personeel volgens specifieke instructies te worden uitgevoerd. De swab wordt vervolgens in een buis met vloeistof geplaatst; het virustransportmedium. Na afname wordt de buis met patiëntmateriaal voorzien van een unieke (bar)code zodat duidelijk is welke buis bij welke patiënt behoort.
Het virustransportmedium zorgt ervoor dat de virusdeeltjes uit de swab in de vloeistof terechtkomen. In deze vloeistof kan het patiëntmateriaal tevens stabiel worden bewaard en getransporteerd wanneer het op de juiste temperatuur wordt opgeslagen.
Sommige laboratoria kiezen ervoor om het materiaal direct in lysisbuffer over te brengen in plaats van via het transportmedium.


Stap 2: Inactivatie van het virus
Op het laboratorium mogen de buizen met mogelijk besmet patiëntmateriaal pas worden geopend op een speciale, veilige werkplek; in een zogenaamde LAF-kast. Deze werkplek zorgt ervoor dat het laboratoriumpersoneel geen virusdeeltjes kan inademen als deze zouden vrijkomen tijdens het openen van de buizen.

In de LAF-kast wordt lysisbuffer aan de afgenomen materialen toegevoegd - indien dit nog niet eerder is gebeurd. Deze lysisbuffer zorgt ervoor dat het virus wordt geïnactiveerd en daarmee niet meer besmettelijk is voor de analist. Daarna kunnen de patiëntmaterialen veilig op het laboratorium worden verwerkt. De hierboven beschreven procedure kan van lab tot lab iets verschillen.

Stap 3: Extractie van het genetisch materiaal
Er zijn verschillende methodes om genetisch materiaal uit patiëntmateriaal te verkrijgen. De geavanceerde testsystemen van Roche draaien met een techniek waarbij gebruik wordt gemaakt van kleine magnetische, met een glaslaagje omhulde bolletjes (< 1/1000e van een millimeter): Magnetic Glass Particles (MGP’s) genoemd. Het proces om genetisch materiaal uit patiëntmateriaal te verkrijgen, kent de volgende stappen:

  • Lysisstap: de celwanden van de humane cellen, bacteriën en virussen die zich in het patiëntmateriaal bevinden, worden kapot gemaakt door het toevoegen van lysisbuffer, enzymen en het verhogen van de reactietemperatuur. Het genetisch materiaal dat zich in de cellen bevindt, komt hierdoor vrij in de vloeistof.
  • Bindingsstap: MGP’s worden toegevoegd aan het patiëntmateriaal. Onder de juiste (chemische) omstandigheden bindt het vrijgekomen genetische materiaal aan deze MGP’s.
  • Wasstap: door een magneet tegen het reactievaatje aan te houden, worden de MGP’s, met daaraan gebonden het genetisch materiaal, vastgehouden. Vervolgens wordt de resterende vloeistof verwijderd en wordt er enkele malen een nieuwe wasvloeistof aan het reactievaatje toegevoegd. Dit zorgt ervoor dat alle mogelijke verontreinigingen worden verwijderd en zuiver genetisch testmateriaal overblijft.
  • Elutiestap: na het wassen wordt de temperatuur in het reactievaatje verhoogd en onder de juiste (chemische) omstandigheden laat het genetisch materiaal weer los van de MGP’s. De resterende vloeistof met daarin het gezuiverde genetisch materiaal wordt vervolgens gebruikt voor de volgende stap van het proces: de real-time PCR-reactie. Opmerking: dit gezuiverde genetisch materiaal bestaat uit materiaal uit alle cellen die aanwezig waren in het patiëntmateriaal. Dat kan genetisch materiaal van de patiënt zelf zijn, maar ook genetisch materiaal van bijvoorbeeld virussen en bacteriën.
COVID-19 testing

Stap 4: real-time PCR-reactie
Voor het aantonen van het SARS-CoV-2 virus in het gezuiverde genetisch materiaal wordt gebruik gemaakt van de zogenaamde real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) technologie. Om te begrijpen hoe een real-time PCR-reactie werkt is het handig om te weten hoe het genetisch materiaal is opgebouwd. Genetisch materiaal bestaat uit één (RNA) of twéé (DNA) strengen van nucleotiden. Er zijn vijf basisnucleotiden: DNA bevat Adenine (A), Cytosine (C), Guanine (G) en Thymine (T). RNA bevat Uracil (U) in plaats van Thymine (T). De volgorde van deze nucleotiden bepaalt de unieke genetische code van elk organisme en wordt ook wel ‘sequentie’ genoemd.

De real-time PCR-reactie vindt plaats in een klein reactievaatje waarin zich de benodigde reagentia bevinden (deze reactiemix bevat soms wel minder dan 1/100e van een milliliter). De reactie bestaat uit een drietal stappen:

 

  1. Denaturatiestap: tijdens deze stap wordt de temperatuur in het reactievaatje verhoogd tot zo’n 95ᵒ C. Dit zorgt ervoor dat één dubbelstrengs DNA-deeltje uiteenvalt in twéé enkelstrengs DNA-deeltjes.
  2. Bindingsstap: vervolgens wordt de temperatuur verlaagd naar zo’n 60ᵒ C. Dit zorgt ervoor dat primers (stukjes kunstmatig gefabriceerde sequenties) die zich in de reactiemix bevinden, kunnen binden aan het enkelstrengs DNA. Deze primers zijn zo ontwikkeld dat ze alleen binden op een specifiek stukje van het genetisch materiaal van het SARS-CoV-2 virus. Naast primers bevinden zich ook probes in de reactiemix. Probes zijn eveneens stukjes kunstmatig gefabriceerde sequenties, maar hieraan is een fluofoor is gekoppeld. Een fluofoor is een chemische stof die onder bepaalde condities een lichtsignaal kan uitzenden (fluoresceren). Ook probes zijn zo ontwikkeld dat ze alleen binden op een specifiek stukje van het genetisch materiaal van het SARS-CoV-2 virus.
  3. Elongatiestap: tijdens deze stap zorgt het polymerase enzym (een eiwit dat een specifieke chemische reactie kan laten verlopen) ervoor dat de primers worden verlengd (letterlijk: het toevoegen van de bouwstenen in de juiste volgorde), waardoor er een kopie wordt gemaakt van een specifiek stukje genetisch materiaal van het SARS-CoV-2 virus. Tijdens deze stap meten we tegelijkertijd het uitgezonden lichtsignaal van de probes. Hoe sneller en sterker het lichtsignaal wordt gemeten, hoe meer probes er gebonden zijn en hoe meer genetisch materiaal van het SARS-CoV-2 virus aanwezig is in de reactiemix.

Bovengenoemde 3 stappen worden tot wel 50x herhaald; deze herhalingen worden cycli genoemd. Tijdens elke cyclus wordt het genetisch materiaal verdubbeld; dit zorgt ervoor dat de hoeveelheid genetisch materiaal exponentieel groeit.

Als het patiëntmateriaal bij de start van de PCR-reactie één virusdeeltje zou bevatten, zou de reactiemix na 40 cycli 1 x 1012 (10 biljoen) kopieën bevatten. In de praktijk bevat patiëntmateriaal echter (veel) meer virusdeeltjes. Het aantal kopieën in de reactiemix zal dus vele malen hoger zijn dan in dit rekenvoorbeeld.

Door gebruik te maken van de real-time PCR-technologie is het mogelijk om zelfs één virusdeeltje aan te tonen en daarmee is deze technologie zeer gevoelig. De technologie is ook zeer specifiek; we zijn in staat om enkel het SARS-CoV-2 virus aan te tonen, ook al is er erfelijk materiaal van andere (micro)organismen in het patiëntmateriaal aanwezig. Zijn de primers of probes echter niet goed ontwikkeld of geproduceerd en is er één nucleotide verkeerd in de kunstmatig gefabriceerde sequentie, dan kan dit resulteren in een foutief resultaat. Ter illustratie: een nucleotide heeft een lengte van ongeveer 0,33 nanometer (0.00000033 millimeter).

Daarom is het heel belangrijk dat het volledige proces van monstername tot PCR-test uiterst zorgvuldig en gecontroleerd verloopt om vals-positieve of vals-negatieve uitslagen te voorkomen. Zowel de commerciële testen als LDT’s worden daarom uitvoerig gevalideerd en alleen uitgevoerd in gecertificeerde laboratoria.

De MMM beoordeelt na de real-time PCR-reactie de gemeten waarden en bepaalt of de testuitslag als positief of negatief moet worden geïnterpreteerd.

Fabrikanten valideren hun testen en systemen op een dusdanige wijze, dat de kans op foutieve resultaten tot een minimum wordt beperkt. Zowel het testsysteem, de (interpretatie)software als de verbruiksartikelen zijn daarom allemaal op elkaar afgestemd en worden volgens de hoogste kwaliteitsstandaarden geproduceerd.

Voor de uitvoering van (nucleïnezuur)extracties en real-time PCR-reacties zijn systemen van diverse firma’s op de markt. Roche levert voor extractie o.a. de MagNA Pure 24 - en MagNA Pure 96 systemen en voor de real-time PCR-reactie het LightCycler® 480 systeem. Soortgelijke systemen worden ook geleverd door firma’s als bioMérieux, Biorad, Thermo Fisher en Qiagen.

Welke moleculaire SARS-CoV-2 testen zijn beschikbaar?  

Laboratoria kunnen in principe kiezen uit drie soorten coronavirustesten:

  1. De door het lab zelf ontwikkelde test of Lab Developed Test (LDT)
  2. Een commercieel beschikbare test voor researchdoeleinden (RUO: Research Use Only)
  3. Een commercieel beschikbare test voor diagnostische doeleinden (CE-IVD: volgens Europese In Vitro Diagnostiek richtlijnen).

 

  1. Lab Developed Test (LDT)
    Het RIVM en het Erasmus MC hebben gezamenlijk een SARS-CoV-2 PCR-test ontwikkeld voor gebruik op Nederlandse laboratoria. Aan het begin van de uitbraak werden deze coronatesten enkel door deze twee laboratoria uitgevoerd. Nadat er steeds meer patiënten besmet raakten met het coronavirus kregen ook andere laboratoria toestemming om deze LDT PCR-test uit te voeren nadat zij konden aantonen dat ze deze test net zo specifiek en net zo gevoelig als het RIVM konden uitvoeren.
  2. Commercieel beschikbare testen voor researchdoeleinden
    TIB MOLBIOL GmbH in Berlijn was de eerste partij die een commerciële kit op de markt bracht. Hiervoor gebruikten zij data die begin januari bekend was gemaakt door wetenschappers uit de Wuhan-regio waar het nieuwe coronavirus voor het eerst opdook.
    De eerste versies van testen zijn vaak uitsluitend voor Research Use Only (RUO) omdat de onderliggende wetenschappelijke data, ten behoeve van het verkrijgen van een CE-IVD certificering, vaak nog ontbreekt. Laboratoria die deze zogenaamde RUO-testen gebruiken, dienen een dergelijke test zelf te valideren voor gebruik in (humane) diagnostiek.
  3. Commercieel beschikbare testen voor diagnostische doeleinden
    Nadat een nieuw ontwikkelde test een klinische studie heeft doorlopen - en daarmee heeft bewezen dat de test ook betrouwbaar kan worden ingezet voor humane diagnostiek én voldoet aan de wettelijke eisen - kan de test een CE-IVD certificering verkrijgen. Dit is een certificering die door bepaalde instanties (de zogenaamde Notified Bodies) mag worden uitgegeven op basis van in vitro diagnostiek-richtlijnen van de Europese Commissie.
    Om het voor firma’s mogelijk te maken snel hun nieuwe coronatest op de markt te kunnen brengen, kan een leverancier het voorlopige Emergency Use Authorization (EUA) label verkrijgen. Dit label wordt alleen in geval van plotselinge uitbraken tijdelijk uitgegeven.
    Inmiddels heeft TIB MOLBIOL ook een CE-IVD versie van haar kit beschikbaar en zijn er legio leveranciers die dergelijke coronatesten aanbieden. Roche levert CE-IVD gecertificeerde SARS-CoV-2 testen voor de cobas® 6800 en cobas® 8800 systemen; dit zijn volautomatische geavanceerde testsystemen waarmee honderden tot duizenden patiëntmaterialen per dag kunnen worden getest. Ook andere firma’s leveren soortgelijke testsystemen zoals Abbott, Becton Dickinson, Cepheid en Qiagen.

Wat is het verschil tussen een moleculaire test en een serologische test?

Zodra iemand geïnfecteerd raakt met het SARS-CoV-2 virus gaat het virus cellen in het lichaam infecteren om een nieuw virus aan te maken. Al naar gelang de ernst van de infectie worden veel nieuwe virusdeeltjes aangemaakt. Een enkel virusdeeltje kan niet zomaar worden aangetoond. Door gebruik te maken van de real-time PCR-reactie kan dit enkele virusdeeltje tot vele miljoenen vermenigvuldigd worden en daarmee aangetoond worden in het patiëntmateriaal.

Bij een moleculaire test toont men de ziekteverwekker zelf aan en is de kans groot dat een persoon het coronavirus kan overdragen op anderen.

Na infectie met een lichaamsvreemd organisme gaat het lichaam in de aanval tegen dit organisme.  Deze aanval kan bestaan uit specifieke cellen die ter plekke de bacterie of het virus aanvallen (bijvoorbeeld fagocyten = cellulaire respons), maar het lichaam kan ook antistoffen gaan aanmaken tegen dit lichaamsvreemde organisme (= humorale respons).

De eerste antistoffen die het lichaam gaat aanmaken (= primaire respons) zijn van het IgM type; hiermee kan worden aangetoond dat men een actieve infectie doormaakt. Het duurt vaak 2-3 weken voordat deze respons op gang komt. Na verloop van tijd neemt deze hoeveelheid antistoffen weer af en worden zogenaamde geheugencellen gemaakt. Deze zorgen ervoor dat, wanneer het lichaam wederom met het lichaamsvreemde organisme in aanraking komt, er snel een grote hoeveelheid antistoffen wordt aangemaakt. Dit wordt de secundaire respons genoemd en deze antistoffen zijn van het IgG type. Hiermee kan dus aangetoond worden dat iemand in het verleden al eerder in aanraking is geweest met het virus.

Bij een serologische test toont men een actieve of een eerder doorlopen infectie aan en dus of een persoon immuniteit heeft opgebouwd.

De immuunrespons bij een mens verloopt echter niet altijd zoals hierboven beschreven. Daarom heeft Roche een totale immuniteitstest ontwikkeld die zowel IgA, IgG en IgM antistoffen aantoont. Andere firma’s leveren ook serologische testen, zoals Abbott en DiaSorin.